EnGen SpRY Cas9 – New England Biolabs

EnGen SpRY Cas9 zo Streptococcus pyogenes je RNA-riadená, DNA endonukleáza, ktorá katalyzuje špecifické štiepenie dvojvláknovej DNA (dsDNA). Na zacielenie je potrebná ~100 nukleotidová jednovláknová RNA (sgRNA) s komplementaritou k 20-nukleotidovej oblasti bezprostredne pred protospacer susediacim motívom (PAM) na substráte dsDNA. EnGen SpRY Cas9 kóduje 11 bodových mutácií (A61R, L1111R, D1135L, S1136W, G1218K, E1219Q, N1317R, A1322R, R1333P, R1335Q, T1337R), ktoré boli navrhnuté na zníženie požiadavky na PAM. Na rozdiel od klasického 5´-NGG-3´ PAM požiadavky divokého typu Spy Cas9, SpRY Cas9 preukázala takmer žiadnu požiadavku na PAM in vitro, štiepením na mnohých miestach s 5´-NNN-3´ PAM (hoci preukazuje preferenciu pre 5´-NRN-3´ pred 5´-NYN-3´ PAM v vivo). Štiepenie DNA EnGen SpRY Cas9 produkuje dvojvláknové zlomy nachádzajúce sa 3 nukleotidy pred PAM. EnGen SpRY Cas9 obsahuje jadrovú lokalizačnú sekvenciu (NLS) antigénu Simian virus 40 (SV40) na C-konci proteínu.

EnGen SpRY Cas9 umožňuje:

• Odstránenie limitácie sekvencie pre zacielenie dsDNA s nešpecifickým PAM (5´-NNN-3´ PAM)
• Úspešne štiepenie veľkých plazmidov pri klonovaní
• Použitie spolu s EnGen sgRNA Synthesis Kit, S. pyogenes (NEB #E3322) , EnGen Mutation Detection Kit (NEB #E3321) a NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (NEB #E2621)